コムギ胚芽抽出液を用いた高効率無細胞タンパク質合成システム（特許出願中） |
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| ■高収率 |
| | 厳選された良質のコムギ胚芽より調製されているため、高いタンパク質合成能を有しています。（図1）
新たに開発された重層法を用いることにより従来のバッチ法に比べ5〜10倍の収率を得ることが可能となりました。 １回の反応（50μlスケール）で最大20μg程度のタンパク質を得ることができます。（図2、3）
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〈参考文献〉Madin K., Sawasaki T., Ogasawara T. and Endo Y.（2000）Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97（2）, 559-564 |
| ■簡便 |
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タンパク質合成は、96-well plateを用いることで簡便に行うことができます。
（専用装置として、無細胞タンパク質合成装置 PG-Mate™をご用意しております）
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| ■確実 |
| | 転写・精製したmRNA*を鋳型として用いるため、各ステップを確認しながら確実に実験を進めることができます**。 |
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| | * mRNAの鋳型となるDNAはcDNAを専用のpEUベクターに組換えて調製します。
** 本キットにはRNA polymerase、RNase
inhibitorは含まれていません。別途準備が必要です。
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目的 | 微生物（Arthrobactor
sp.）由来Sarcosine oxidaseおよび制限酵素Bam
HIをPROTEIOS™を用いて合成し、酵素活性を測定する。
＜タンパク質の特徴＞ | Sarcosine
oxidase | 補酵素としてフラビン（FAD）を要求する。無細胞系ではアポ酵素として合成される。 | 制限酵素Bam
HI | 組換え微生物で合成する場合、細胞毒性を示すため、同時にメチラーゼを発現させる必要のある酵素である。 |
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方法 | Sarcosine
oxidaseおよび制限酵素Bam
HI遺伝子をpEUベクターにサブクローニングし、T7 RNA
polymeraseによりmRNAを調製、得られたmRNAを鋳型に重層法を用いてタンパク質合成を実施する。その後、SDS-PAGE解析、及び活性測定を行う。
Sarcosine oxidaseは補酵素のない状態で合成したため、酵素活性測定時にFADを加え、活性を測定した。
また、制限酵素Bam
HIについては、λDNAを基質として、切断パターンから認識配列についても確認を行った。
| 結果 | 反応液4μlを用いてSDS-PAGE解析を行ったところ、それぞれCBB染色にてタンパク質を確認することができた（図4）。また、酵素活性を測定したところ、各々活性が認められ、比活性は標品とほぼ同様であった（図5）。
また、Bam
HIの認識配列も従来の酵素と同一であることが確認できた。 | |
| 品名および内容 |
包装 |
保存温度 |
価格 |
| PROTEIOS™
Ver.2 set (CPS-801) |
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98,000 |
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+Wheat germ cell-free protein synthesis core kit* |
（20回用） |
−80℃ |
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Wheat
germ extract
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0.22ml |
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Creatine
kinase
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0.1ml |
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Buffer
#1
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2.2ml |
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Buffer
#2-2 |
2.5ml |
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Ribonuclease
inhibitor(40U/ul) |
25ul |
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| +Plasmid
set |
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pEU-DHFR
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30μl |
−20℃ |
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pEU3-NII |
30μl |
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| PROTEIOS™
Ver.2 set (CPS-803) |
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|
240,000 |
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+Wheat germ cell-free protein synthesis core kit* |
（60回用） |
−80℃ |
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Wheat
germ extract
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0.66ml |
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Creatine
kinase
|
0.3ml |
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Buffer
#1
|
6.6ml |
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Buffer
#2-2 |
7.5ml |
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Ribonuclease
inhibitor(40U/ul) |
65ul |
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| +Plasmid
set |
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pEU-DHFR
|
30μl |
−20℃ |
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pEU3-NII |
90μl |
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| PROTEIOS™
Ver.2 set Mini (CPS-801M) |
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|
43,000 |
| +Wheat
germ cell-free protein synthesis core kit* |
（5回用） |
−80℃ |
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Wheat
germ extract |
55μl |
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Creatine
kinase |
30μl |
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Buffer
#1 |
550μl |
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Buffer
#2-2 |
630μl |
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Ribonuclease
inhibitor(40U/ul) |
10ul |
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| +Plasmid
set |
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pEU-DHFR |
30μl |
−20℃ |
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pEU3-NII |
20μl |
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| Thermo
T7 RNA polymerase |
7,500U |
−20℃ |
12,000 |
| ScriptMAX™
Thermo T7 Transcription Kit |
26ul×60回用 |
−20℃ |
28,000 |
| Microsome-High™
Canine Pancreatic Microsome Membranes |
50ul |
−80℃ |
39,000 |
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| * Wheat
germ cell-free protein synthesis core kit には RNA
polymerase は添付されていません。また、mRNAの精製にG-25マイクロスピンカラムが必要となります。別途ご準備ください。 |
